Hei acolo! Sunt un furnizor de celule TET - 213, iar astăzi vă voi plimba cum să efectuați colorarea imunofluorescenței pe aceste celule. Colorarea imunofluorescenței este o tehnică super utilă în lumea biologiei celulare. Ne ajută să vizualizăm proteine specifice în celule, oferindu -ne o mai bună înțelegere a funcțiilor și locațiilor lor.
Pregătirea TET - 213 celule
În primul rând, trebuie să ne pregătim TET - 213 celule. Începeți prin creșterea lor într -un mediu de cultură adecvat. De obicei, aceste celule se descurcă bine într -un mediu precum RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser bovin fetal (FBS) și 1% penicilină - streptomicină. Incubați celulele la 37 ° C într -o atmosferă de 5% CO₂.
Odată ce celulele ajung la aproximativ 70 - 80% confluență, este timpul să începeți procesul de colorare. Va trebui să însămânțați celulele pe copertine într -o placă de 24 de ani. Acest lucru face mai ușor să gestionați celulele în timpul etapelor de colorare. Folosiți o pipetă pentru a transfera cu atenție suspensia celulei pe copertinele. Asigurați -vă că distribuiți celulele uniform.
Fixarea celulelor
După ce celulele s -au atașat de copertine (de obicei după 24 de ore), este timpul să le remediați. Fixarea este crucială, deoarece păstrează structura celulară și menține proteinele la locul lor. Puteți utiliza un fixativ precum 4% paraformaldehidă (PFA) în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Adăugați suficient PFA pentru a acoperi celulele de pe copertine și lăsați -l să stea la temperatura camerei timp de aproximativ 15 - 20 minute.
Odată ce fixarea este făcută, spălați celulele de trei ori cu PBS. Fiecare spălare ar trebui să dureze aproximativ 5 minute. Acest lucru ajută la eliminarea oricărui exces de fixativ din celule.
Permeabilizare
Următoarea este permeabilizarea. Această etapă permite anticorpilor să intre în celule și să se lege de proteinele țintă. Utilizați un agent de permeabilizare precum 0,1% Triton X - 100 în PBS. Adăugați soluția de permeabilizare la celule și lăsați -o să se incubeze la temperatura camerei timp de aproximativ 10 minute.
După aceea, spălați celulele de trei ori cu PBS din nou, la fel ca în pasul anterior. Acest lucru asigură că agentul de permeabilizare este eliminat complet.
Blocare
Blocarea este o etapă importantă pentru a preveni legarea non -specifică a anticorpilor. Puteți utiliza o soluție de blocare, cum ar fi 5% albumină serică bovină (BSA) în PBS. Adăugați soluția de blocare la celule și lăsați -o să se incuieze la temperatura camerei timp de aproximativ 1 oră.
Incubarea primară de anticorpi
Acum este timpul să adăugați anticorpul primar. Anticorpul primar este specific proteinei pe care doriți să o detectați în celulele TET - 213. Diluați anticorpul primar în soluția de blocare conform instrucțiunilor producătorului.
Îndepărtați cu atenție soluția de blocare din celule și adăugați anticorpul primar diluat. Asigurați -vă că acoperiți celulele complet cu soluția de anticorpi. Incubați celulele cu anticorpul primar peste noapte la 4 ° C. Acest timp lung de incubație permite anticorpului să se lege eficient la proteina țintă.
A doua zi, spălați celulele de trei ori cu PBS, cu fiecare spălare care durează aproximativ 5 minute. Acest lucru scapă de orice anticorp primar nelimitat.
Incubarea de anticorpi secundari
După incubarea primară de anticorpi, este timpul pentru anticorpul secundar. Anticorpul secundar este etichetat cu un colorant fluorescent, ceea ce ne permite să vizualizăm proteina țintă la un microscop fluorescent.
Diluați anticorpul secundar în soluția de blocare conform instrucțiunilor producătorului. Scoateți PBS din celule și adăugați anticorpul secundar diluat. Incubați celulele la temperatura camerei timp de aproximativ 1 - 2 ore în întuneric. Mediul întunecat este important pentru a preveni decolorarea colorantului fluorescent.
Odată ce incubarea s -a terminat, spălați celulele de trei ori cu PBS, la fel ca înainte.
Contracarare
Contracinarea este utilizată pentru a vizualiza nucleele celulare. Puteți utiliza un colorant precum DAPI (4 ', 6 - diamidino - 2 - fenilindol). Diluați DAPI în PBS și adăugați -l la celule. Lăsați -l să se incubeze la temperatura camerei timp de aproximativ 5 minute.
După aceea, spălați încă o dată celulele cu PBS pentru a îndepărta orice exces DAPI.
Montare
În cele din urmă, este timpul să montați copertinele pe diapozitive la microscop. Folosiți un mediu de montare, care ajută la menținerea celulelor la locul lor și, de asemenea, păstrează fluorescența. Puneți cu atenție o picătură de mediu de montare pe un diapozitiv la microscop și apoi inversați copertina pe picătură. Asigurați -vă că nu există bule de aer prinse între copertă și diapozitiv.
Imagistica
Acum sunteți gata să imaginați celulele sub un microscop fluorescent. Utilizați filtrele corespunzătoare pentru a vizualiza semnalele fluorescente de la anticorpul secundar și DAPI. Puteți lua mai multe imagini în diferite câmpuri de vedere pentru a obține o reprezentare bună a celulelor.
Utilizarea peptidelor înrudite în acest proces
În timpul culturii celulare și a procesului de colorare, s -ar putea să găsiți, de asemenea, unele peptide utile. De exemplu,(Gly14) -umanin (om)S -a dovedit că are unele efecte benefice asupra viabilității și funcției celulare. Puteți să o adăugați la mediul de cultură pentru a vedea dacă afectează expresia proteică pe care o studiați în celulele TET - 213.
Fibronectină CS1 peptidăPoate fi folosit pentru a acoperi copertinele înainte de a însămânța celulele. Acest lucru poate îmbunătăți atașarea și răspândirea celulelor, ceea ce face ca procesul de colorare să fie mai eficient.
Endotelin - 1 (11 - 21)De asemenea, ar putea juca un rol în căile de semnalizare din celulele TET - 213. Puteți să o adăugați la mediul de cultură și apoi să studiați cum afectează expresia proteinei țintă prin colorarea imunofluorescenței.
Concluzie
Efectuarea colorației de imunofluorescență pe celulele TET - 213 poate fi un proces complicat, dar dacă urmați cu atenție acești pași, ar trebui să puteți obține rezultate grozave. Este o tehnică puternică care vă poate oferi informații valoroase asupra biologiei acestor celule.
Dacă sunteți interesat să achiziționați TET - 213 celule sau oricare dintre peptidele aferente menționate în acest blog, nu ezitați să ne contactați pentru mai multe informații și să începeți o discuție despre achiziții. Suntem aici pentru a vă ajuta cu toate nevoile dvs. de biologie celulară.
Referințe
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Biologia moleculară a celulei. Science Garland.
- Pollard, TD, & Earnshaw, WC (2004). Biologia celulară. Saunders.